Перинатальный центр г. Саранск. Официальный сайт
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ МОРДОВИЯ "МОРДОВСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ КЛИНИЧЕСКИЙ ПЕРИНАТАЛЬНЫЙ ЦЕНТР"
ЭЛЕКТРОННЫЙ АДРЕС:
perinatrm@mail.ru
СПРАВОЧНАЯ СЛУЖБА:
8 (8342) 76-17-58
ПРИЕМНАЯ ДИРЕКТОРА:
8 (8342) 76-08-37
РЕГИСТРАТУРА:
8 (8342) 76-27-99
ГРАФИК РАБОТЫ:
с 8:00 до 18:00
  • СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ ЖЕНЩИНАМ
  • МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ МУЖЧИНАМ
    СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ МУЖЧИНАМ
  • МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ ДЕТЯМ
    СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ ДЕТЯМ
  • ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
    ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕЧЕНИЯ
    НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕЧЕНИЯ
ЗАПИСАТЬСЯ НА ПРИЕМ
Записаться на прием онлайн, так же можно на сайте Мед РМ
Ф.И.О:
Телефон:
E-mail:
Выберите отделение:
Дата приема:
Время приема:
Ваше сообщение:
Введите проверочный код:
шесть + пять =

Эмбриология и оценка качества эмбрионов

Одним из важнейших этапов программы ЭКО является эмбриологический этап. Именно от того, как будет выполнена оценка качества яйцеклетки, проведена процедура оплодотворения, а также последующее культивирование зигот и эмбрионов зависит успешный результат экстракорпорального оплодотворения.

Эмбриологический этап программы ЭКО длится не более 6-7 суток. Условно его можно разделить на несколько стадий, описание которых приведено далее.

День «-1» - подготовительная стадия

На данной стадии эмбриолог готовит все необходимые материалы для проведения процедуры пункции фолликулов и оплодотворения. В этот день маркируются и номеруются все планшеты, чашки Петри, ставятся на прогрев (необходимо строгое соблюдение температурного режима) и эквилибровку (доведение рН до величин 7.35-7.45) все среды, необходимые для промывки фолликулов и ооцитов, обработки спермы и оплодотворения.

День «0» — пункция фолликулов (аспирация яйцеклеток) и оплодотворение

На момент пункции фолликулов, яйцеклетки находятся в виде ооцитарно-кумулюсного комплекса (ОКК). Фолликулярную жидкость, полученную при трансвагинальной пункции эмбриолог проверяет под стереомикроскопом (или невооруженным глазом) на наличие ОКК, которые  выглядят как сизые слизистые сгустки размером 5-10 мм. Быстро отобранные ОКК помещаются в культуральную среду, где специалист предварительно оценивает их количество, качество и степень зрелости. Важно понимать, что морфология  комплексов не всегда позволяет дать истинную оценку степени зрелости и состояния самой яйцеклетки.

У пунктированной яйцеклетке должно быть закончено первое деление мейоза, после которого отделяется первое полярное тельце. Второе деление, как правило, находится в стадии метафазы. Хромосомы образуют ряд, создавая тем самым метафазную пластинку, располагающуюся прямо над полярным тельцем. При этом в яйцеклетке осуществляется блок мейоза, снять который способен лишь сперматозоид, проникнувший сквозь оболочку.

На приведенных ниже фотографиях приведены примеры зрелых и незрелых яйцеклеток. Ооцит человека с «идеальными» параметрами имеет светлую, умеренно гранулярную цитоплазму, небольшое перивителлиновое пространство,  интактное первое полярное тело, круглую и бесцветную зону пеллюцида. Однако более 50% всех получаемых ооцитов в циклах стимуляции суперовуляции имеют одну и более морфологическую аномалию!

Согласно современным представлениям, качество ооцита имеет критическое значение для развития эмбриона и наступление клинической беременности!

Сперматозоиду, перед тем, как проникнуть в ооцит, следствием чего становится оплодотворение яйцеклетки, предстоит преодолеть ряд препятствий. Во-первых, кумулюс (Сumulus) — проникая вовнутрь него глубже, сперматозоид увеличивает свою скорость, демонстрируя фазу гиперактивности. Во-вторых, зона пеллюцида (Zona pellucida) — здесь сперматозоид связывается с рецептором.

После этого осуществляется реакция, при которой цитоплазматическая мембрана яйцеклетки и мембрана сперматозоида объединяются. Содержимое акросомы сперматозоида выбрасывается, связывается с зоной пеллюцида и сперматозоид проникает через оболочку яйцеклетки, не теряя своей активности.

На том месте, которое располагается между оболочкой яйцеклетки и зоной пеллюцида, сперматозоид присоединяется своими рецепторами к рецепторам, которые располагаются на оболочке яйцеклетки. Это способствует возникновению кортикальной реакции, которая становится причиной необратимых процессов зоны пеллюцида, что делает её недоступной для проникновения других сперматозоидов.

Подобным образом осуществляется оплодотворение в естественном цикле и в технике ЭКО (IVF). При тяжелых формах мужского бесплодия, а также при низком количестве/качестве полученных при трансвагинальной пункции ооцитов, применяется процедура интрацитоплазматического переноса сперматозоида непосредственно в цитоплазмы ооцита (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection, сокращенно ICSI или ИКСИ). Впервые микроинъекцию сперматозоида в яйцеклетку провели Uehara и Yanagimachi в Японии в 1976 году. ИКСИ является самой распространенной микроманипуляционной техникой искусственного оплодотворения, которая в настоящее время широко используется в качестве технологий вспомогательной репродукции человека. Процедуре ИКСИ предшествуют денудация ооцита (обработка препаратами фермента гиалуронидаза, денюдирование (удаление клеток кумулюса)), обработка спермы (простое центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотностей, swim up).

День «1» – оценка оплодотворения:

Через 16-18 часов после проведения процедуры ИКСИ, или через 18-20 часов после IVF, оценивается наличие признаков оплодотворения и качество зигот. Наличие в яйцеклетке 2-х пронуклеусов (PN) и 2 полярных тел (PB) указывает на нормальное развитие процесса оплодотворения. Пронуклеусы — это ядра половых клеток (сперматозоида и яйцеклетки) несущих по половине генетического материала от каждого родителя.

На этой стадии очень важно отбраковать аномально оплодотворившиеся эмбрионы: моноплоиды (1 пронуклеус), триплоиды (3) и полиплоиды (4 и более).

Зиготы с 3 ядрами (пронуклеусами) могут появляться в результате:

  1. Оплодотворения ооцита 2-мя и более сперматозоидами (чаще всего 2-мя сперматозоидами оплодотворяются яйцеклетки неудовлетворительного качества)
  2. Оплодотворения ооцита аномальным сперматозоидом с двойным набором хромосом (все клетки человека имеют 46 хромосом - диплоидный набор). Зрелая яйцеклетка и сперматозоид имеют 23-гаплоидный набор. Образование сперматозоида с двойным набором хромосом (46) происходит при нарушениях процесса созревания гамет.
  3. Невыделение ооцитом 2-го полярного тельца. Процесс созревания яйцеклетки — это хромосомные преобразования ведущие к формированию ооцита с гаплоидным набором хромосом. Гаплоидность достигается за счёт выделения 2-х полярных телец. Первое формируется у яйцеклетки готовой к оплодотворению, второе можно увидеть после оплодотворения, т.е. в норме видно 2 полярных тельца.

Полиплоиды появляются в результате оплодотворения яйцеклетки неудовлетворительного качества несколькими сперматозоидами или в результате сочетания вышеперечисленных факторов.

День «2» — начало дробления

На 2-е сутки после слияние генетического материала сперматозоида и яйцеклетки происходит дробление — деление клетки на 2 или 4. Клетки дробящегося эмбриона называются бластомерами.

Градация эмбрионов по качеству является условной и различается в разных лабораториях. На этой стадии эмбриолог оценивает качество эмбриона по степени фрагментации (проценту безъядерных фрагментов цитоплазмы), чем она больше — тем ниже считается потенциал этого эмбриона к имплантации и дальнейшему развитию. Помимо фрагментации оценивается форма и относительные размеры бластомеров (T.Hardarson, 2001). Широко используемая классификация дробящихся эмбрионов по качеству — классификация A-B-C-D, где A — эмбрион отличного качества без ануклеарных (безъядерных) фрагментов (например, 4А).

Тип В — эмбрион хорошего качества с содержанием ануклеарных фрагментов до 20% (4В)

Тип С — эмбрион удовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов от 21% до 50% (4С)

Тип D — эмбрион неудовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов более 50% (4D)

На этой стадии, а также на день «3», оценивается равномерность бластомеров, порядок их ориентации относительно друг друга и, по возможности, количество ядер в них (в норме по 1).

День «3» – дробление

Еще через сутки эмбрион, как правило, уже состоит из 4-х, 6-ти или 8-ми бластомеров. Генетическая программа эмбриона запускается на 4-х клеточной стадии, в конце вторых — начале третьих суток развития. До этого момента эмбрион развивался исключительно за счет «запасов», накопленных в яйцеклетке за время ее роста и развития в яичнике. Именно на третьи сутки запускается генетическая программа сперматозоиды, и, если «генетическая книга», в которой закодирована программа нормального развития эмбриона, содержит ошибки - некие «опечатки» или мутации, эмбрион останавливается в развитии. Это природный процесс отбора генетически нормальных эмбрионов. Поэтому именно на стадии 4-8 бластомеров до 20 % эмбрионов останавливаются в развитии (так называемый «блок развития»).

Причинами плохого качества эмбрионов могут быть плохое качество спермы или плохое качество яйцеклетки. Считается, что если эмбрион плохо растет изначально, то проблема в яйцеклетке, а если развитие первые двое суток идет хорошо, а потом начинаются проблемы, то дело в плохом качестве спермы.

День «4» — морула

На 4-е сутки развития эмбрион человека состоит уже, как правило, из 10-16 клеток, межклеточные контакты постепенно уплотняются и поверхность эмбриона сглаживается (процесс компактизации) — начинается стадия морулы (от лат. morulae — тутовая ягода). К этой стадии in vivo (в организме матери) эмбрион попадает из маточной трубы в полость матки. К концу 4-х суток развития внутри морулы постепенно образуется полость — начинается процесс кавитации.

Чаще оценку морулы (компактизированного эмбриона) проводят по методике предложенной Tao J et al. в 2002 году. Согласно данной методике в основу берется степень компактизации бластомеров:

М 4 (А): эмбрион полностью компактизован. Клеточные мембраны видны нечетко, но ядра различимы.

М 3 (В): компактизовано более 75% бластомеров. Эмбрион сохраняет сферичную форму и гладкую поверхность.

М 2 (С): частичная компактизация (около 50% бластомеров), аномальная морфология эмбриона.

М 1 (D): компактизация менее 50% бластомеров. Различимы безъядерные фрагменты и некомпактизовавшиеся бластомеры.

Пример записи — (М3) — морула с компактизацией более 75% бластомеров.

День «5» — бластоциста

С того момента, как полость внутри морулы достигает более 50% ее объема, эмбрион называется бластоцистой.

В норме формирование бластоцисты допускается с конца 4-х до середины 6-х суток развития, чаще это происходит на 5-е сутки. Бластоциста состоит из двух популяций клеток — трофобласт (трофэктодерма (ТЭ), однослойный эпителий, окружающий полость) и внутренняя клеточная масса (ВКМ (ICM), плотный комок клеток). Трофобласт отвечает за имплантацию — внедрение эмбриона в маточный эпителий (эндометрий). Клетки трофобласта дадут в дальнейшем начало всем внезародышевым оболочкам развивающегося плода, а из внутренней клеточной массы будут формироваться все ткани и органы будущего ребенка. Чем больше полость бластоцисты и лучше развита внутренняя клеточная масса и трофобласт — тем больше потенциал эмбриона к имплантации. Когда полость бластоцисты достигает значительного размера, истончившаяся за счет растяжения блестящая оболочка (ZP) разрывается и начинается процесс хэтчинга (выклева) эмбриона из блестящей оболочки. Только после окончания этого процесса бластоциста способна имплантироваться (прикрепиться) в эндометрий матки. Имплантация происходит, как правило, на 5-7 день развития эмбриона.

Общепринятой классификацией эмбрионов на стадии бластоцисты является классификация предложенная D.Gardner с соавт. в  1999 году. Согласно ей оценивается степень бластуляции, а также состояние внутриклеточной массы и трофобласта. Ниже перечислены критерии оценки бластоцисты.

Бластуляция:

1 степень — ранняя бластоциста, полость бластоцисты меньше половины объема эмбриона.

2 степень — полость бластоцисты больше половины объема эмбриона.

3 степень — полная бластоциста. Полость полностью занимает объем эмбриона.

4 степень — расширенная бластоциста. Полость бластоцисты становится больше и начинает истончаться ZP.

5 степень — трофэктодерма ничинает проникать через ZP.

6 степень — вылупившаяся бластоциста, покинувшая ZP.

Внутриклеточная масса (ВКМ):

А — плотно упакованная с большим количеством клеток.

В — более свободная группировка среднего количества клеток.

С — незначительное количество клеток

Трофэктодермальный слой:

А — много клеток, формирующих трофэктодерму.

В — немного клеток.

С — незначительное количество больших клеток.

Пример записи — (4АА) — расширенная бластоциста, ВКМ — плотно упакованная с большим количеством клеток, много клеток формирующих трофэктодерму.

Вспомогательный хетчинг

Несмотря на то, что репродуктивная медицина в последние годы заметно «шагнула вперед», далеко не во всех случаях лечение бесплодия с первой попытки завершается наступлением долгожданной беременности. Чтобы повысить эффективность проводимых процедур, на сегодняшний день разработан ряд определенных методик, повышающих шансы на имплантацию зародыша и дальнейшее благополучное развитие беременности. Одной из таких методик является вспомогательный хэтчинг (от англ. to hatch out - «вылупиться из яйца»).

Человеческий зародыш на ранних стадиях своего развития окружен в блестящую прозрачную гликопротеиновую оболочку (латинское название «zonae pellucidae»), выполняющую роль защитной скорлупы, которая обеспечивает кортикальную реакцию, выборочное поступление питательных веществ эмбриону и позволяет уберечь его от механических повреждений. В процессе деления клеток под действием особых природных механизмов и ферментов она истончается и в определенное время (обычно на 5-7 сутки деления) разрывается и «сползает», что позволяет эмбриону выйти из нее и успешно имплантироваться во внутреннюю слизистую оболочку матки — эндометрий.

Однако по ряду причин этот процесс, как в естественных условиях, так и в условиях ЭКО протекает правильно далеко не всегда, что препятствует дальнейшему наступлению беременности. И именно такую проблему при проведении экстракорпорального оплодотворения специалисты решают с помощью вспомогательного хэтчинга — искусственного надсечения блестящей оболочки эмбриона в условиях лаборатории. Это повышает вероятность имплантации зародыша и дальнейшего прогрессирования беременности при условии правильной подготовки эндометрия к принятию оплодотворенной яйцеклетки.

На сегодняшний день существует несколько методик проведения хэтчинга, каждая из которых имеет свои особенности:

  • Механический хэтчинг - механическое воздействие на прозрачную оболочку эмбриона и носит название частичного рассечения. Специальной микроиглой блестящую оболочку дважды прокалывают под определенным углом, благодаря чему формируется узкая прорезь, через которую бластоциста может быстрее выйти своей блестящей оболочки.
  • Химический хэтчинг - воздействие на оболочку специальным разъедающим химическим раствором (кислый раствор Тироде), который микроинструментами наносят на ее небольшую область. В оболочке образуется небольшое отверстие диаметром 20 ± 7 мкм, после чего раствор убирают, а зародыш несколько раз промывают во избежание повреждающего воздействия агрессивного вещества на его клетки.
  • Хэтчинг с помощью лазерного излучения - выполняется тонким лазерным лучом, которым через оптическую линзу бесконтактным путем делают надсечки на оболочке (при помощи сквозного повреждения или чаще локального ее истончения). Эта методика является точной, безопасной и эффективной, при этом наиболее оптимальным ее видом считается применение инфракрасных лучей диаметром 1480 нм.
  • Пьезо-методика - осуществляется при помощи пьезоэлектрического микроманипулятора, имеющего высокочастотную микровибрацию, оставляющего конические углубления на ограниченном участке оболочки и тем самым способствующим ее истончению.

Несмотря на то, что вспомогательный хетчинг уже много лет считается рутинной процедурой, его целесообразно применять далеко не во всех случаях проведения программ ВРТ. В одних случаях хэтчинг является особенно актуальным, а в других он никак не влияет на частоту наступления беременности.

Специалистами установлен ряд возможных показаний к проведению данной манипуляции в программах ЭКО:

  • возраст женщины более 38 лет
  • курение
  • несколько предшествующих неудачных попыток ЭКО
  • плохие морфологические показатели эмбрионов
  • утолщенная оболочка эмбриона и другие ее аномалии
  • высокий уровень фолликулостимулирующего гормона в крови
  • перенос эмбрионов после криоконсервации

В этих случаях методика вспомогательного хэтчинга может быть наиболее эффективна.